如何選擇符合需求的HPLC或UHPLC色譜柱

1.利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過(guò)去幾年里，柱效和使用超高效色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過(guò)更快速的分離和更快速的方法開發(fā)提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)力來(lái)證明了其價(jià)值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個(gè)參數(shù)中，選擇性是最為重要的。

（參見圖1）通過(guò)利用柱效和選擇性，通常可以實(shí)現(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對(duì)分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對(duì)分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個(gè)問題，因此其成為開發(fā)分離方法時(shí)的最佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動(dòng)相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用

ACE 鍵合相	疏水性結(jié)合	π–π	氫鍵結(jié)合	偶極-偶極	形狀選擇性
C18	強(qiáng)	無(wú)	無(wú)	無(wú)	弱
C18-HL	極強(qiáng)	無(wú)	無(wú)	無(wú)	弱
C18-AR	強(qiáng)	強(qiáng)	中等	中等	中等
C18-PFP	強(qiáng)	強(qiáng)	強(qiáng)	強(qiáng)	強(qiáng)
AQ	中等	無(wú)	中等	弱	無(wú)
C8	中等	無(wú)	無(wú)	無(wú)	無(wú)
C4	弱	無(wú)	無(wú)	無(wú)	無(wú)
苯基	中等	強(qiáng)	弱	中等	弱
CN	弱	無(wú)	弱	強(qiáng)	無(wú)

利用鍵合相的選擇性實(shí)現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來(lái)更好的分離效果。對(duì)于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)開發(fā)分離方法時(shí)，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。

非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過(guò)利用柱效和選擇性，可以實(shí)現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動(dòng)相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測(cè)： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至100%B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡因
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實(shí)例。

一個(gè)分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個(gè)分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得卓越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至100%B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV 254 nm

樣品
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。

2.ACE和ACE Excel硅膠基質(zhì)固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響，并且在為堿性化合物提供卓越峰形方面贏得了口碑。

峰拖尾可以降低分離度，降低靈敏度，甚至干擾準(zhǔn)確度和精密度（圖4）。

峰拖尾有許多潛在的原因，但分離堿性物質(zhì)時(shí)的主要原因是硅膠固定相載體顆粒表面上的酸性硅醇基與分析物上的氨基之間的相互作用（圖5）。

圖 4：峰拖尾對(duì)分離度和靈敏度的影響

隨著峰拖尾（Tf，拖尾因子）從1.0增加到2.0，分離度（Rs）從1.5下降到0.87。

由于峰寬增加以及峰面積保持不變，靈敏度（峰高）也隨著峰拖尾的增加而下降。

ACE色譜柱采用具有極低硅醇活性的超惰性硅膠制成。

這種超純硅膠采用專利技術(shù)進(jìn)行有效鍵合和徹底封尾。

導(dǎo)致這種硅膠基質(zhì)的固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響。

ACE色譜柱的超惰性特性使其成為分離極性堿性化合物的理想選擇。

當(dāng)分離復(fù)雜堿性化合物時(shí),與其他現(xiàn)代堿性去活色譜柱相比，ACE色譜柱總是能給出明顯更好的峰形和柱效（圖6）。

圖 5：峰拖尾相互作用

硅膠固定相載體表面上的酸性硅醇基可形成與堿性化合物相互作用的離子交換位點(diǎn)。

這種離子交換的相互作用通常可以導(dǎo)致峰保留（二次保留），并當(dāng)采用反相HPLC分離胺類化合物時(shí)引起峰拖尾。

一種幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離不利影響的硅膠基質(zhì)固定相

圖 6：峰拖尾比較

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm
流動(dòng)相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
溫度：22oC
樣品：吡啶

報(bào)告了堿性化合物（吡啶）在各種常見C18色譜柱上的塔板數(shù)。

在10％峰高下測(cè)量塔板數(shù)，以使峰拖尾納入在測(cè)量中。

ACE C18-PFP由于其超惰性性質(zhì)而達(dá)到了最高塔板數(shù)。

3.ACE Excel為UHPLC帶來(lái)了享有盛譽(yù)的ACE HPLC性能

重要的是要認(rèn)識(shí)到色譜柱的選擇性和柱效是獨(dú)立的變量，在開發(fā)分離方法時(shí)您不必選擇使用一種而不使用另一種。事實(shí)上，為了實(shí)現(xiàn)最佳的總體分離效果，您應(yīng)當(dāng)對(duì)上述兩個(gè)變量以及保留值進(jìn)
行優(yōu)化。當(dāng)需要實(shí)現(xiàn)高速分離時(shí)尤其如此。（參見圖7）

圖 7：利用柱效和鍵合相選擇性來(lái)開發(fā)更快的分離方法

條件：
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱溫：40℃
檢測(cè)：PDA, 254nm

樣品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色譜柱更高的柱效，可在更高的流動(dòng)相流速下使用更短的色譜柱，以使這種混合物的分離時(shí)間縮短80%（相比HPLC色譜柱）。
然而，也可以通過(guò)優(yōu)化鍵合相的選擇性來(lái)進(jìn)一步縮短分離時(shí)間，在這個(gè)案例中，就是利用了C18-PFP鍵合相所具有的增強(qiáng)的選擇性。

與C18UHPLC色譜柱、C18 HPLC色譜柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色譜柱分別將混合物的分離時(shí)間縮短了80％以上以及96％，同時(shí)保持了所有峰的極佳分離度。

ACE Excel UHPLC色譜柱的設(shè)計(jì)旨在充分利用低擴(kuò)散、超高壓UPLC®和UHPLC儀器（高達(dá)1000 bar），并可與所有市售UPLC和UHPLC系統(tǒng)相兼容。
ACE Excel UHPLC色譜柱可以為堿性化合物提供更佳的峰形，改善柱子與柱子之間的重現(xiàn)性，提供額外的利用多種分離機(jī)制的固定相，以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色譜柱的可用性意味著色譜分析師在使用UPLC和UHPLC儀器時(shí)有更多的選擇來(lái)獲得更好的結(jié)果。

圖 8：ACE Excel色譜柱提供快速、高分辨率的分離

條件
色譜柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流動(dòng)相：60秒內(nèi)從30%B至100%B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱溫：40oC
壓力：703 bar (10,335 psi)
檢測(cè)：PDA, 254 nm
儀器：安捷倫1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色譜柱可在不到60秒內(nèi)提供這9種分析物的基線分離。

4.已經(jīng)證實(shí)ACE HPLC色譜柱和ACE Excel UHPLC色譜柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和卓越的色譜柱壽命。

通過(guò)鍵合在硅膠固定相載體上的硅氧烷的酸化水解可以失去鍵合相，從而降低色譜柱的壽命。該酸水解隨著流動(dòng)相pH的降低和柱溫的升高而增加。

與C18相相比，較短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去鍵合相。此外，低純度的硅膠固定相載體和低表面覆蓋的固定相載體使得一些鍵合相更易于酸解。
由于使用超高純度的硅膠固定載體粒子以及鍵合相的極高表面覆蓋，ACE鍵合相表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性。（參見圖9）
盡管所有ACE鍵合相的穩(wěn)定性都很優(yōu)異，但是一些鍵合相并不像其它鍵合相那樣穩(wěn)定。例如，通常認(rèn)為C18鍵合比柱長(zhǎng)較短的烷基相、PFP相和苯基鍵合相更穩(wěn)定。

實(shí)際上，典型的苯基固定相穩(wěn)定性不佳是該相在方法開發(fā)中不常被選擇的主要原因之一。
為了解決這個(gè)問題而開發(fā)了ACE C18-AR，其允許色譜分析利用強(qiáng)大的π-π和偶極-偶極分離機(jī)制，并仍然享有C18相的堅(jiān)固性及耐用性。

如圖10所示，ACE C18-AR不僅對(duì)典型的苯基鍵合相具有非常優(yōu)異的穩(wěn)定性，它甚至還比許多其他C18鍵合相表現(xiàn)出更佳的穩(wěn)定性。

類似地，ACE C18-PFP提供了多種分離機(jī)制，可以利用它們實(shí)現(xiàn)更佳的總體分離效果，同時(shí)從C18相的穩(wěn)定性中受益。

圖 9：酸穩(wěn)定性，pH 1.8

條件
色譜柱：ACE 4.6 x 150 mm
流動(dòng)相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
溫度：22 °C
分析物：菲

酸性暴露條件：
流動(dòng)相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
溫度：22 ℃

圖10：加速柱穩(wěn)定性研究：pH 1.9時(shí)80℃

酸性暴露條件：
流動(dòng)相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
溫度：80 ℃
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲

使用設(shè)計(jì)用于加速柱降解下的條件，ACE C18-AR相顯示保留損失極少，其壽命相當(dāng)于高度穩(wěn)定的ACE C18相。兩種固定相均由相同的超純硅膠而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾視作在高溫和低pH條件下具有極好穩(wěn)定性的固定相）。
正如預(yù)期的那樣，基于低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）的C18鍵合柱在這些加速條件下壽命大大降低。
特別值得注意的是常規(guī)苯基色譜柱與ACE C18-AR的壽命比較結(jié)果。與ACE C18-AR相比，盡管使用高純度二氧化硅，苯基色譜柱的壽命仍降低，這表明ACE C18-AR可能適用于那些使用苯丙基色譜柱壽命短的應(yīng)用。

將HPLC和UHPLC連接到通常被稱為L(zhǎng)C-MS的質(zhì)譜儀上已經(jīng)相當(dāng)普遍。

然而，質(zhì)譜對(duì)可能從HPLC/UHPLC色譜柱上洗脫下來(lái)的微量的鍵合相（稱為柱“流失”）非常敏感。柱

流失可能會(huì)干擾分析結(jié)果，并且重要的是，LC-MS應(yīng)用中所選擇的色譜柱具有足夠穩(wěn)定的鍵合相以避免過(guò)量的柱流失。

圖11表明ACE C18-PFP色譜柱幾乎沒有“流失”干擾LC-MS分析。

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的穩(wěn)定性使得這些色譜柱更適合LC-MS應(yīng)用。

圖 11：ACE C18-PFP色譜柱的低柱流失使其成為L(zhǎng)C/MS應(yīng)用中的理想選擇

條件
色譜柱尺寸：50 x 3.0 mm
流動(dòng)相：梯度：在5分鐘內(nèi)從5至95% B，95% B時(shí)持續(xù)5分鐘
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
溫度：60oC
檢測(cè)：安捷倫1100 MSD ESI正離子快速掃描模式,快速掃描全50 – 1000 m/z
樣品：空白運(yùn)行

柱流失可能會(huì)干擾LC-MS應(yīng)用中目標(biāo)分析物的檢測(cè)和測(cè)量。

ACE C18-PFP色譜柱未顯示柱流失。

所有ACE色譜柱的低流失特性使其非常適合LC-MS應(yīng)用。

UHPLC色譜柱可能缺乏耐用性。加上入口篩板堵塞的可能性，您可能面臨色譜柱的耐用性不如HPLC色譜柱的問題。

ACE Excel色譜柱非常寬容，并提供您期望從HPLC色譜柱中獲得的相同耐用性和使用壽命。

ACE Excel將改變您對(duì)UHPLC色譜柱耐用性的看法。

ACE Excel色譜柱不僅填裝的更好，還采用了專利的入口篩板設(shè)計(jì)，使其比其它UHPLC色譜柱更不容易被堵塞。

仍建議您像使用任何UHPLC色譜柱一樣過(guò)濾樣品和流動(dòng)相，但ACE Excel色譜柱比其他UHPLC色譜柱更為寬容，并提供與HPLC色譜柱相同的耐用性和使用壽命。

圖 12：ACE Excel色譜柱在耐用性方面有良好的口碑

將2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色譜柱在平均1,000 bar（14,500 psi）壓力下進(jìn)行2000多個(gè)梯度的運(yùn)行。

在該穩(wěn)定性研究結(jié)束時(shí)，柱效（塔板數(shù)）和保留時(shí)間基本保持不變。

5.ACE Excel色譜柱具有口碑卓越的可重現(xiàn)性。

柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性受硅膠固定相載體的生成、固定相與固定相載體的鍵合以及色譜柱中固定相的填充的影響。

在色譜柱的制備過(guò)程中，每個(gè)階段被控制得越好，色譜柱的可重現(xiàn)性和質(zhì)量則越好。
ACE色譜柱在色譜柱制備過(guò)程中的每個(gè)階段均得到了全面控制。

這些控制措施確保ACE色譜柱在柱間以及批次之間產(chǎn)生可靠且可預(yù)測(cè)的性能。

圖13提供了典型批次驗(yàn)證測(cè)試的實(shí)例。

硅醇活性的細(xì)微變化是柱子與柱子之間選擇性變化的主要原因之一。

ACE和ACE Excel色譜柱由于使用超純?cè)噭┖蛧?yán)格的制造工藝控制（可以獲得具有均一表面特性的高純度硅膠固定相載體）而具有出色的可重現(xiàn)性。

將這種高純度硅膠與先進(jìn)的鍵合技術(shù)相結(jié)合，可以產(chǎn)生一系列高惰性的固定相，這些固定相幾乎消除了色譜中的硅醇干擾，從而提供卓越的柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性。

6.ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴(kuò)展性。

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，或需要分離和純化目標(biāo)化合物時(shí)放大到制備應(yīng)用上。

柱效當(dāng)然會(huì)改變，但可以預(yù)料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當(dāng)使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進(jìn)行操作時(shí)，可以預(yù)見到分析物一致的譜帶間距類型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴(kuò)展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時(shí)，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動(dòng)相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長(zhǎng)：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明分離從UHPLC擴(kuò)展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當(dāng)使用ACE Excel UHPLC色譜柱進(jìn)行快速方法開發(fā)，且該方法必須可轉(zhuǎn)移到HPLC時(shí)，易擴(kuò)展性則顯得特別有價(jià)值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無(wú)論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動(dòng)相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時(shí)持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時(shí)持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測(cè)：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運(yùn)行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明ACE固定相的選擇性一致，無(wú)論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉(zhuǎn)移更加容易。同時(shí)也使得從分析型應(yīng)用擴(kuò)展到制備型應(yīng)用更加容易。